Почему клетки окрашиваются по-разному
У грамположительных бактерий толстый слой пептидогликана. Комплекс кристаллического фиолетового с йодом задерживается в нём при обработке спиртом, и клетки остаются сине-фиолетовыми.
У грамотрицательных бактерий пептидогликана мало, а снаружи есть липидная наружная мембрана. Спирт растворяет её и вымывает краситель, бесцветные клетки затем докрашивают контрастным красным красителем — они розово-красные.
Что понадобится
- кристаллический (генциановый) фиолетовый — раствор или фильтровальная бумага, пропитанная красителем;
- раствор Люголя;
- 96-процентный этиловый спирт или смесь спирта с ацетоном;
- контрастный краситель — водный фуксин или сафранин;
- контрольные культуры: грамположительная, например Staphylococcus aureus, и грамотрицательная, например Escherichia coli.
Порядок окраски
Время этапов в разных прописях различается — ориентируйтесь на СОП своей лаборатории и инструкцию к набору красителей.
- Мазок. Тонкий, равномерный, из молодой культуры (обычно 18–24 ч). Высушите на воздухе.
- Фиксация. Проведите стекло мазком вверх через пламя горелки 2–3 раза или зафиксируйте метанолом. Не перегревайте: при пережоге клетки деформируются и красятся неправильно.
- Кристаллический фиолетовый — около 1 минуты. Слейте краситель.
- Раствор Люголя — около 1 минуты: йод образует с красителем крупный комплекс. Слейте.
- Обесцвечивание спиртом — самый ответственный этап. Наносите спирт, наклонив стекло, пока с мазка перестанет стекать фиолетовая краска; обычно это 10–30 секунд. Сразу промойте водой.
- Контрастный краситель — фуксин или сафранин, от 30 секунд до 1–2 минут. Промойте водой, высушите.
- Микроскопия с иммерсионной системой.
Контроль окраски
Каждый раз, особенно с новой партией красителей и при обучении сотрудников, наносите на то же стекло контрольные культуры: грамположительную и грамотрицательную. Если контроль окрасился неправильно, результат исследуемого мазка недостоверен.
Типичные ошибки
| Что видно | Возможная причина |
|---|---|
| грамположительные выглядят красными | пережали обесцвечивание; старая культура; пережог при фиксации; слишком тонкий мазок |
| грамотрицательные выглядят фиолетовыми | недостаточное обесцвечивание; слишком толстый мазок |
| в одном мазке клетки разного цвета | грамвариабельная или старая культура; неравномерная толщина мазка |
| осадок красителя, «грязный» фон | краситель не отфильтрован; препарат пересох между этапами |
| клетки деформированы | перегрев при фиксации |
Старые культуры. У части грамположительных бактерий — бацилл, клостридий, коринебактерий — в стареющей культуре стенка разрушается, и клетки начинают окрашиваться грамотрицательно. Поэтому для окраски берут молодую культуру.
Если результат сомнителен
Простой дополнительный тест — проба с 3-процентным раствором гидроксида калия: колонию размешивают в капле на стекле. У грамотрицательных бактерий клетки лизируются, и при подъёме петли тянется слизистая нить; у грамположительных нити нет. Тест не заменяет окраску, но помогает при вариабельных результатах.
Материал подготовлен редакцией и ждёт проверки экспертами сообщества. Нашли неточность — напишите нам: исправления вносим и отмечаем дату.