Зачем нужен
Коагулазный тест отделяет Staphylococcus aureus и другие коагулазоположительные стафилококки (КПС) от коагулазоотрицательных, например S. epidermidis и S. saprophyticus. В пищевой микробиологии это обязательный шаг подтверждения по ГОСТ 31746-2012: культуру относят к КПС, если это грамположительные каталазоположительные кокки, которые свёртывают плазму кролика (п. 9.4).
Положительный тест — ещё не S. aureus. Плазму свёртывают и другие виды: S. intermedius, S. pseudintermedius, S. hyicus, S. schleiferi subsp. coagulans, S. delphini, S. lutrae, S. argenteus. Чтобы отнести КПС к S. aureus, ГОСТ 31746-2012 требует проверить образование ацетоина и сбраживание мальтозы.
Принцип: две формы коагулазы
- Связанная коагулаза, или фактор слипания (clumping factor), закреплена на клеточной стенке и связывает фибриноген напрямую: в капле плазмы клетки склеиваются в комочки. Её выявляет тест на стекле.
- Свободная коагулаза выделяется в среду, взаимодействует с фактором плазмы и образует тромбиноподобное вещество. Оно превращает фибриноген в фибрин, и плазма в пробирке сворачивается за несколько часов.
Свёртывание плазмы в пробирке вызывает прежде всего свободная коагулаза; в инструкции одного из изготовителей плазмы сказано, что пробирочный тест выявляет обе формы. Тест на стекле выявляет только связанную, поэтому его чувствительность ниже.
| Вариант | Что выявляет | Время | Роль |
|---|---|---|---|
| в пробирке с плазмой | прежде всего свободную коагулазу | 4–24 ч | референсный тест, предусмотрен ГОСТ 31746-2012 |
| на стекле | фактор слипания | секунды | предварительный ответ |
| латекс-агглютинация | фактор слипания, белок A, поверхностные антигены S. aureus | до 30 с | быстрый скрининг |
Что понадобится
- чистая культура в бульоне с вытяжкой из сердца и мозга, выращенная из отдельной колонии при (37 ± 1) °C (24 ± 3) ч (ГОСТ 31746-2012, п. 8.1.5);
- плазма кролика с ЭДТА — обычно сухая промышленная, её восстанавливают и хранят по инструкции изготовителя. Если плазма стабилизирована цитратом, ГОСТ требует добавить ЭДТА до 0,1 % (п. 5.3): бактерии, использующие цитрат, — Pseudomonas, Serratia marcescens, Enterococcus faecalis, часть стрептококков — сворачивают цитратную плазму без всякой коагулазы;
- стерильные пробирки, например 10 × 75 мм, пипетки, термостат на 37 °C;
- контрольные штаммы (см. ниже).
Порядок: тест в пробирке по ГОСТ 31746-2012
- Убедитесь, что культура — грамположительные кокки и каталазоположительна: коагулазу проверяют только у таких культур (п. 9.3.1).
- В стерильную пробирку внесите 0,1 мл бульонной культуры и 0,3 мл плазмы, если изготовитель плазмы не указал других объёмов.
- Для каждой партии плазмы поставьте контроль: 0,1 мл стерильного бульона с той же плазмой, без культуры.
- Инкубируйте при 37 °C.
- Через 4–6 ч осторожно наклоните пробирку и оцените сгусток. Не встряхивайте её: сгусток может сжаться или разрушиться.
- Если сгустка нет, посмотрите ещё раз через 24 ч или через срок, указанный изготовителем плазмы.
- Оцените степень свёртывания по шкале и запишите её в журнал.
| Оценка | Что видно | Вывод по ГОСТ 31746-2012 |
|---|---|---|
| − | фибрин не образовался | отрицательно |
| 1+ | мелкие несформированные комочки | промежуточная реакция |
| 2+ | небольшой сформированный комок | промежуточная реакция |
| 3+ | большой сформированный комок | положительно |
| 4+ | свернулось всё содержимое, сгусток не смещается при переворачивании | положительно |
Критерии в разных документах различаются. ГОСТ 31746-2012 считает положительными реакции 3+ и 4+. На рисунке 1 стандарта реакции 1+ и 2+ подписаны как «положительная оценка», но в тексте п. 9.3.3 они названы промежуточными — ориентируйтесь на текст. Методика FDA BAM для пищевых продуктов признаёт S. aureus без оговорок только при плотном сгустке, который не сдвигается при наклоне и переворачивании (4+); частичное свёртывание проверяют дополнительными тестами, например на термостабильную нуклеазу. В инструкции к одной из промышленных плазм положительной считается любая степень свёртывания, а хлопья и нити — нет. Работайте по документу из области аккредитации.
Другие варианты в ГОСТ 31746-2012:
- петлю культуры с плотной среды вносят прямо в пробирку с разведённой плазмой; если за 6 ч при (37 ± 1) °C сгусток не образовался, пробирки оставляют на 24 ч при (30 ± 1) °C (п. 9.3.4);
- ускоренный вариант: две капли бульонной культуры через 2 ч после появления видимого роста добавляют к 0,5 мл разведённой плазмы и учитывают через 30 мин — 4 ч (п. 9.3.5);
- на агаре Бэрд-Паркера с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном коагулазу показывает зона преципитации вокруг колонии, и отдельный тест не нужен (п. 9.3.2).
ГОСТ 31746-2012 модифицирован по отношению к ISO 6888 изданий 1999 и 2003 годов. Если лаборатория работает по действующим ISO 6888-1:2021 или ISO 6888-2:2021 (обе с изменением 1 от 2023 года), объёмы и критерии сверяйте с их текстом.
Тест на стекле и латекс-агглютинация
Колонию растирают на стекле или карточке и смешивают с каплей реагента — плазмы или реагента набора; порядок задаёт инструкция к набору. Если при перемешивании клетки за секунды склеиваются, у культуры есть фактор слипания. В латексных наборах частицы покрыты фибриногеном и антителами, поэтому реагируют ещё белок A и поверхностные антигены S. aureus.
Ограничения:
- Штаммы S. aureus без фактора слипания дают отрицательный результат; по данным изготовителя одного из наборов, они чаще встречаются среди штаммов ветеринарного происхождения. Отрицательный или сомнительный ответ перепроверяют в пробирке.
- Часть метициллинорезистентных S. aureus (MRSA) латексный тест может не выявить.
- Положительно могут реагировать S. hyicus, S. intermedius, S. lugdunensis, S. schleiferi, изредка S. sciuri (ныне Mammaliicoccus sciuri).
- Латекс читают не позже 30 с: более поздняя агглютинация бывает ложноположительной у коагулазоотрицательных стафилококков.
- Колонии со сред с высоким содержанием соли (маннит-солевой агар; солевой средой является и ЖСА) или с антибиотиками дают тягучие, неоднозначные агрегаты. Изготовители рекомендуют свежую культуру, выращенную за ночь.
Для чего годятся: быстро отобрать колонии и получить предварительный ответ. ГОСТ 31746-2012 описывает только реакцию с плазмой кролика — в пробирке или в среде с плазмой и фибриногеном. Методика FDA BAM допускает замену пробирочного теста определённым латексным набором, если нужен ускоренный ответ.
Контроль
- Каждая партия плазмы: пробирка с плазмой и стерильным бульоном без культуры не должна свернуться (ГОСТ 31746-2012, п. 9.3.3). Качество плазмы проверяют на коагулазоположительном и коагулазоотрицательном штаммах (п. 5.3).
- Положительный и отрицательный контроль ставят одновременно с испытуемыми культурами (FDA BAM).
- Штаммы, которые изготовители плазмы и латексных наборов указывают для контроля:
| Контроль | Штамм | ATCC | WDCM |
|---|---|---|---|
| положительный | Staphylococcus aureus | 25923 | 00034 |
| отрицательный | Staphylococcus epidermidis | 12228 | 00036 |
О хранении и пассажах контрольных культур — в статье о тест-штаммах.
Ложные результаты
| Ошибка | Результат | Почему |
|---|---|---|
| пробирку смотрят только через 24 ч | ложноотрицательный | фибринолизин некоторых штаммов растворяет сгусток, образовавшийся в первые часы |
| пробирку встряхивают | ложноотрицательный | сгусток сжимается или разрушается |
| культура старше 18–24 ч или рост скудный | ложноотрицательный | фермента может не хватить для свёртывания |
| тест на стекле у штамма без фактора слипания | ложноотрицательный | свободную коагулазу этот тест не выявляет |
| цитратная плазма без ЭДТА | ложноположительный | бактерии, использующие цитрат, сворачивают плазму |
| хлопья или нити фибрина приняли за сгусток | ложноположительный | это не сгусток |
| латекс прочитали позже 30 с | ложноположительный | неспецифическая агглютинация |
| культура не чистая | любой | посторонний микроорганизм при долгой инкубации искажает результат |
| плазма свернулась в контроле | тест недействителен | плазма непригодна |
| положительный тест записали как S. aureus | ошибка идентификации | плазму свёртывают и другие виды КПС |
Меры предосторожности
- Культуры стафилококков — потенциально патогенные микроорганизмы; работайте по правилам для их группы патогенности.
- Плазма — материал животного происхождения; изготовители рекомендуют обращаться с ней как с потенциально инфицированной.
- На стекле колонию эмульгируют без брызг, использованные стёкла и карточки сразу погружают в дезинфицирующий раствор.
- Пробирки и остатки культур обеззараживают перед утилизацией.
- Плазму, которая свернулась при восстановлении, загрязнена или изменила цвет, не используют.
Источники
- ГОСТ 31746-2012, официальное издание (скан) — приготовление и контроль плазмы (п. 5.3), постановка и учёт коагулазного теста, шкала сгустка (п. 9.3, рисунок 1), виды КПС (приложение А)
- FDA BAM, Chapter 12: Staphylococcus aureus — критерий 4+, дополнительные тесты при частичном свёртывании, контроли, замена латексным тестом
- Biolife, Coagulase Plasma EDTA, инструкция TS-429936 rev 2 (копия в закупочной документации) — свободная и связанная коагулаза, учёт через 4 и 24 ч, фибринолизин, цитратная плазма, коагулазоположительные виды, контрольные штаммы, меры предосторожности
- Thermo Fisher, Staphaurex Plus, инструкция по применению — принцип латекс-агглютинации, учёт в течение 30 с, MRSA, перекрёстные реакции, солевые среды, контрольные штаммы
- Oxoid, Staphylase Test, инструкция по применению — выявление фактора слипания, штаммы без него, реакции S. sciuri
Материал подготовлен редакцией и ждёт проверки экспертами сообщества. Нашли неточность — напишите нам: исправления вносим и отмечаем дату.