Термины ГОСТ ISO 11133-2016
| Термин | Что это |
|---|---|
| контрольный (эталонный) штамм — reference strain | микроорганизм, полученный непосредственно из официальной коллекции культур (члена WFCC или ECCO), определённый как минимум до рода и вида и описанный в каталоге |
| контрольные (эталонные) исходные культуры — reference stock | набор одинаковых отдельных культур, полученных одним пересевом эталонного штамма — в лаборатории или у поставщика |
| исходная культура — stock culture | первый пересев эталонной исходной культуры |
| рабочая культура — working culture | пересев эталонной исходной культуры, исходной культуры или стандартного образца |
| стандартный образец — reference material | однородный и стабильный материал с определённым количеством жизнеспособных микроорганизмов |
В других документах ступени называются иначе. В МУ 2.1.4.1057-01 это «запас эталонной культуры» (длительное хранение при −70 °C или в жидком азоте), «запас рабочей культуры» (временное хранение в полужидком агаре при 4–8 °C) и «культура для целевого использования», которая идёт в анализ. Встречаются и переводы «эталонный запас», «запасная культура». Сопоставляйте ступени по смыслу, а не по словам.
Схема: движение только в одну сторону
По приложению В ГОСТ ISO 11133-2016 культуры ведут так:
- Получают эталонный штамм, проверяют и сохраняют документы на него, восстанавливают культуру по инструкции поставщика.
- Высевают на плотную среду — например, агар с 5 % овечьей крови или триптон-соевый агар — и проверяют чистоту и характеристики: морфологию колоний, окраску по Граму или биохимическую идентификацию.
- Готовят суспензию в криозащитной среде — например, в триптон-соевом бульоне с 10–15 % глицерина, — разливают по криопробиркам (в них могут быть бусины) и замораживают. Это эталонная исходная культура.
- Для работы одну криопробирку быстро оттаивают или восстанавливают культуру по инструкции поставщика и высевают на плотную среду. После проверки чистоты и морфологии культура на плотной среде и есть рабочая культура — этот вариант стандарт называет предпочтительным. Для некоторых штаммов, например для количественных испытаний, сначала готовят исходную культуру, а из неё — рабочую.
Обратного хода нет (пп. 5.3.3–5.3.5). Эталонную исходную культуру не используют, чтобы получить «новый» эталонный штамм. Исходную культуру — чтобы получить эталонный штамм или пополнить эталонные исходные культуры. Рабочую культуру — ни для чего, кроме инокулята: из неё не готовят исходные культуры и следующие рабочие культуры.
Сколько пересевов допускается
ГОСТ ISO 11133-2016 не называет предельного числа пересевов. Он требует документировать их число, чтобы не допустить избыточного субкультивирования, повышающего риск фенотипических изменений (п. 5.3.1). Одним пересевом считается перенос жизнеспособной культуры в свежую среду, после которого есть рост. Получая штамм от поставщика, лаборатория выясняет, сколько пересевов было сделано до неё (п. 5.3.2).
Конкретные пределы задают другие документы — их соблюдают, если работают по ним:
- МУК 4.2.2316-08 (контроль питательных сред, п. 7.2): тест-штаммы из лиофилизированного состояния или со среды хранения — не более трёх последовательных пересевов, свежевыделенные штаммы — не более 3–5. Для контроля сред рекомендована культура II–III пассажа: после первого пассажа жизнеспособность снижена.
- МУ 2.1.4.1057-01 (лаборатории воды, раздел 10): для работы пригодны культуры, прошедшие не более двух пассажей после высева со среды хранения рабочего запаса.
- Фармакопейные испытания по USP (например, глава <51>): не более пяти пассажей от исходной культуры коллекции. Само размораживание или регидратация ампулы пассажем не считается.
Способы хранения
| Способ | Условия | Документ |
|---|---|---|
| Глубокое замораживание в криопробирках, в том числе на бусинах | ниже −70 °C — длительно; при более высокой температуре срок хранения ограничен | ГОСТ ISO 11133-2016, п. 5.3.3, приложение В |
| Криохранение по МУ для лабораторий воды | −(70 ± 10) °C или жидкий азот; запас закладывают один раз на 3–5 лет | МУ 2.1.4.1057-01, п. 10.3 |
| Лиофилизация (ампулы) | 2–8 °C, жизнеспособность сохраняется не менее 10 лет; при −30…−69 °C — до 30 лет | МУК 4.2.2316-08, п. 7.2.2 |
| Коммерческие системы с бусинами в криопробирке | по инструкции изготовителя | ГОСТ ISO 11133-2016, п. 5.3.4 |
| Агар в пробирке, обычно скошенный (исходная культура) | например, триптон-соевый агар, в том числе с овечьей кровью: 24 ч инкубации, затем до четырёх недель при 18–25 °C или 2–8 °C в зависимости от микроорганизма | ГОСТ ISO 11133-2016, рисунок В.2 |
| Полужидкий агар (запас рабочей культуры) | 4–8 °C. Без криохранения запас восполняют каждые 3 месяца, не более трёх раз, через год вскрывают новую ампулу (п. 10.2). При криохранении запас создают заново раз в 3 месяца из новой криопробирки (п. 10.3.3) | МУ 2.1.4.1057-01 |
Культуры, взятые в работу, используют ограниченное время. ГОСТ ISO 11133-2016 приводит примеры: исходную культуру на плотной среде с отдельными колониями — в течение 14 дней (п. 5.4.2.1), рабочую культуру в бульоне — не более трёх дней (п. 5.4.2.2), пробирку с агаром — до четырёх недель (рисунок В.2). Точные сроки устанавливает лаборатория.
Два правила для замороженного запаса:
- Оттаявшую пробирку повторно не замораживают — это прямо запрещено МУ 2.1.4.1057-01 (п. 10.3.3). Поэтому запас раскладывают по многим маленьким порциям: по МУ (п. 10.3.2) — 4–5 криопробирок по 1 мл на каждый планируемый год хранения.
- Из флакона с бусинами обычно стерильно извлекают одну бусину, не давая остальному содержимому оттаять, и как можно скорее возвращают флакон в морозильник; извлечённую бусину обратно не кладут. Порядок работы — по инструкции изготовителя системы.
Маркировка и записи
СанПиН 3.3686-21 требует на каждой первичной ёмкости с культурой, находящейся на хранении, чёткую несмываемую надпись или прочно наклеенную этикетку: видовое название, при наличии — обозначение штамма и инвентарный номер, дату лиофилизации или пересева. Для морозильника выбирайте этикетки и маркеры, которые не отклеиваются и не стираются на холоде.
В журнале ведения культур удобно записывать:
- штамм, номер коллекции, источник, дату получения, документ поставщика;
- дату закладки запаса, число пробирок и их расход;
- каждый пересев с номером пассажа, средой, датой и исполнителем;
- результаты проверки чистоты и свойств.
Пример календарного плана работы с культурой на 3–5 лет приведён в приложении 7.3 к МУ 2.1.4.1057-01.
Проверка после восстановления
- После каждого восстановления культуру проверяют на чистоту и морфологию колоний; для культур от коммерческих поставщиков — и на нужные характеристики (ГОСТ ISO 11133-2016, рисунок В.2). Изолированные колонии получают посевом истощающим штрихом.
- Перед закладкой на длительное хранение и перед восполнением рабочего запаса штамм проверяют на соответствие паспортным свойствам и отсутствие диссоциации (МУ 2.1.4.1057-01, п. 10.1).
- Если изменённых, полиморфных колоний больше 25 %, культура для контроля непригодна. Этот критерий есть и в МУК 4.2.2316-08, и в МУ 2.1.4.1057-01 (там для E. coli просматривают не менее 30 колоний).
- Если и вторая пробирка из запаса не прошла проверку, линию снимают с хранения и начинают заново с новой ампулы (МУ 2.1.4.1057-01, п. 10.3.3).
Как проверять сами среды тест-штаммами — в статье о тест-штаммах.
Биобезопасность и учёт
Большинство тест-штаммов — патогенные биологические агенты (ПБА). По приложению 1 к СанПиН 3.3686-21 к IV группе патогенности относятся, например, Escherichia coli (кроме продуцентов веротоксина — это II группа), Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Salmonella spp., к III группе — Listeria monocytogenes, Legionella pneumophila и Candida albicans. Группу каждого штамма проверяйте по этому приложению. Статья касается только штаммов III–IV групп. Работа с ними требует разрешительных документов и условий по СанПиН 3.3686-21. Подробнее — в статье о группах патогенности.
Раздел IV СанПиН 3.3686-21 в общих чертах требует:
- вести учёт наличия, количества и передвижения культур, а уничтожение культур и штаммов регистрировать в журнале; журналы на бумаге нумеруют и прошивают;
- хранить ПБА в специально определённом помещении «заразной» зоны — в холодильнике, морозильнике или металлическом шкафу, раздельно по группам, в герметичной первичной ёмкости внутри прочной вторичной тары;
- вторичную тару опечатывать; диагностическим лабораториям, работающим только с III–IV группами, вместо этого разрешено использовать запирающиеся холодильники и шкафы;
- порядок формирования рабочих коллекций и сроки хранения культур у сотрудников определяет руководитель подразделения и утверждает приказ по организации;
- отработанные культуры обеззараживать физическими методами, обычно автоклавированием, в режимах из приложения 2 к СанПиН.
Типичные ошибки
- рабочую культуру пересевают «с пробирки на пробирку» и делают из неё следующие рабочие культуры;
- оттаявшую криопробирку замораживают снова или ради одной бусины размораживают весь флакон;
- нет записей о пассажах и дате закладки запаса — нельзя доказать, что штамм не изменился;
- после восстановления не проверяют чистоту и диссоциацию, и контроль сред проводят на изменённой культуре;
- этикетка стёрлась в морозильнике;
- культуры уничтожают без обеззараживания или без записи в журнале.
Источники
- ГОСТ ISO 11133-2016 — карточка и текст на files.stroyinf.ru — термины 3.4, пункты 5.3–5.4, приложение В
- МУК 4.2.2316-08 — текст на ohranatruda.ru — пункт 7.2: пересевы, восстановление и хранение тест-штаммов
- МУ 2.1.4.1057-01 — текст на meganorm.ru — раздел 10: ведение эталонных культур
- СанПиН 3.3686-21 — текст на base.garant.ru — раздел IV: учёт, хранение и передача ПБА, обеззараживание; приложение 1: ПБА по группам патогенности
- ATCC: Reference strains — how many passages are too many? — ограничение USP в пять пассажей, определение пассажа
Материал подготовлен редакцией и ждёт проверки экспертами сообщества. Нашли неточность — напишите нам: исправления вносим и отмечаем дату.