Ростовые свойства питательных сред: как проверить и оформить результат

Что проверяют

В ГОСТ ISO 11133-2016 это эксплуатационные испытания среды. Стандарт выделяет три свойства (п. 3.2):

Кроме того, у каждой партии оценивают внешний вид, цвет, однородность, толщину слоя или объём, консистенцию и влажность геля, pH (п. 6.2), а также стерильность: для партии меньше 100 единиц — хотя бы одну чашку или пробирку (п. 6.3.3).

Плотные среды: коэффициенты PR и SF

Количественный метод (п. 7.2.2) сравнивает новую партию с неселективной контрольной средой — чаще всего триптонным соевым агаром (TSA), — а в особых случаях с ранее принятой партией той же среды. Контрольная среда сама должна быть проверенного качества (п. 6.3.2).

• Доза. Около 100 КОЕ на чашку: лучше 80–120, не меньше 50 (п. 5.4.2.5.1.1). При 100 колониях точность подсчёта около ±20 %, при 20 — около ±47 % (таблица 1). Подробнее — в статье о пределах подсчёта.
• Коэффициент производительности PR = Ns / No, где Ns — общее число колоний на испытуемой среде, No — на контрольной.
• Критерии (п. 7.2.2.1.2): PR не менее 0,50 для селективной среды против неселективной контрольной; не менее 0,70 для неселективной среды, если стандарт или приложения E и F не требуют иного. Если PR больше 1,4, выясняют причину.
• Условия достоверности: рост есть на каждой чашке, а число колоний не выходит за рабочий диапазон — не больше 100 на фильтре и не больше 150 при поверхностном посеве.
• Коэффициент селективности SF = Do − Ds, где Do и Ds — наибольшие разведения нецелевого штамма (в log10), дающие рост на контрольной и сопоставимый рост на селективной среде. SF должен быть не менее 2.

Есть и качественный метод — штриховой посев (п. 7.4.1): рост оценивают баллами 0 — нет роста, 1 — слабый, 2 — выраженный. Целевой штамм должен дать 2 с типичными колониями, нецелевой — частично или полностью подавиться.

Значения PR удобно вести на контрольной карте (приложение G); для её построения нужно не менее 10 испытаний разных партий одной среды. Карту можно построить в калькуляторе.

Жидкие среды

Раздел 8 стандарта предлагает три подхода:

1. Метод разведения до нулевого уровня (п. 8.2) — количественный, для селективных и неселективных сред, в том числе для сред НВЧ. Пробирки засевают десятикратными разведениями культуры, затем из каждой высевают петлёй 10 мм³ на неселективный агар. Норма — выраженный рост (не менее 10 КОЕ с петли) из разведений, содержащих менее 100 КОЕ в 0,1 мл; для селективных сред SF не менее 2.
2. Качественный метод для селективных бульонов (п. 8.3): целевой штамм — не более 100 КОЕ, нецелевой — не менее 1000 КОЕ, при необходимости смесь в одной пробирке. Норма — не менее 10 колоний или сплошной штрих целевого штамма на специфичной для него среде и отсутствие роста (менее 10 колоний) нецелевого на неселективном агаре.
3. Оценка мутности (п. 8.4) — для неселективных бульонов и подтверждающих сред, по шкале 0–1–2. Среду предварительного обогащения засевают дозой не более 100 КОЕ. Норма по п. 8.4.3 — выраженная мутность (2), но в таблицах E.1 и F.1 для части бульонов указана мутность 1–2. Непрозрачные среды проверяют высевом на плотную среду.

Тест-штаммы и доза

Приложение E содержит штаммы и критерии для сред пищевой микробиологии, приложение F — для микробиологии воды: для каждой среды — режим инкубации, штаммы по номерам WDCM, контрольная среда, метод и ожидаемая реакция. Штаммы с пометкой b — обязательный минимум.

Пример — агар Бэрд-Паркера (таблица E.1): производительность проверяют Staphylococcus aureus WDCM 00034 против TSA (PR не менее 0,5, чёрные или серые колонии с зоной просветления), селективность — Escherichia coli WDCM 00012 или 00013 (полное подавление), специфичность — Staphylococcus saprophyticus WDCM 00159 (колонии без просветления).

Ориентиры по дозе (п. 5.4.2.5): для селективности — 10⁴–10⁶ КОЕ нецелевого штамма, для специфичности — 10³–10⁴ КОЕ, для качественных испытаний сред в чашках — 10³–10⁴ КОЕ. Номера коллекций и хранение — в статье о тест-штаммах.

Что описывают МУК 4.2.2316-08

МУК утверждены 18 января 2008 года для изготовителей сред, разработчиков и тех, кто готовит среды из компонентов; их можно применять и при внутрилабораторном контроле коммерческих сред. Набор показателей зависит от назначения среды (приложение 1):

• чувствительность — наибольшее разведение культуры, дающее видимый рост на всех засеянных чашках или пробирках; скорость роста — минимальное время до отчётливого роста;
• показатель прорастания — среднее число колоний на испытуемой среде к среднему на контрольной, в процентах; для плотных сред;
• ингибирующие свойства — подавление сопутствующей микрофлоры;
• дифференцирующие свойства — у сред для выделения проверяют посевом смеси возбудителя и сопутствующего штамма в соотношениях 1:1 и 1:10, у сред для идентификации — штаммами с положительной и отрицательной реакцией;
• эффективность — для накопительных сред; нейтрализующие свойства — для сред контроля стерильности иммунобиологических препаратов.

Работают культурой II пассажа, не более трёх последовательных пересевов после восстановления: взвесь стандартизуют до 10 единиц по отраслевому стандартному образцу мутности, готовят десятикратные разведения и высевают по 0,1 мл на 3 чашки. От серии берут не менее трёх образцов; годной её признают только после всех видов контроля. Штаммы, разведения и инкубация для зарегистрированных сред — в приложении 2.

По смыслу показатель прорастания близок к PR, ингибирующие свойства — к селективности, дифференцирующие — к специфичности, но методики и числа различаются, поэтому в процедуре лаборатории указывают документ, по которому ведут контроль.

Как часто проверять

• Каждую партию — до использования (ГОСТ ISO 11133-2016, п. 6.1). Если среда нестабильна, её проверяют параллельно с исследованием проб.
• Среды из сухих смесей: для сред, на которых считают колонии, — количественно; для остальных часто достаточно качественной проверки (п. 6.4.3).
• Готовые среды с сертификатом изготовителя можно не проверять полностью, но лаборатория сверяет критерии изготовителя со своими, а среды с добавками проверяет хотя бы качественно; периодически — после доставки, хранения и расплавления (п. 6.4.2).
• Срок годности приготовленных сред подтверждают проверкой в конце срока хранения (п. 4.4.2.2).
• Частоту остальных проверок устанавливает лаборатория (п. 6.4.1).
• По МУК 4.2.2316-08 коммерческие среды контролирует изготовитель, а лаборатория проверяет их сама только в перечисленных в МУК случаях — например, при неудаче во внешней оценке качества, нетипичных колониях, позднем росте или слабом подавлении сопутствующей микрофлоры. Для внутрилабораторного контроля МУК называют внешний вид, pH, стерильность каждой серии и проверку контрольными штаммами.
• Для фармакопейного испытания на стерильность ростовые свойства проверяют у каждой серии промышленной среды и каждой лабораторной партии (ОФС.1.2.4.0003.15).

Пример записи

Форма ниже составлена по образцу карточки из приложения D ГОСТ ISO 11133-2016; числа условные.

Записи хранят в течение срока, установленного системой качества лаборатории (п. 10.2 «Прослеживаемость»). Журнал приготовления сред для печати — в разделе «Журналы».

Типичные ошибки

• Контрольная среда не проверена — PR считают относительно сомнительной партии TSA.
• Доза мала: при 15–30 колониях на чашке погрешность PR слишком велика.
• Селективную среду проверяют только целевым штаммом.
• PR больше 1,4 не разбирают, хотя это повод проверить контрольную среду и подсчёт.
• Рабочую культуру пересевают «по цепочке», хотя из рабочей культуры нельзя готовить следующую (п. 5.3.5).
• Не ищут причину брака. Частые причины по приложению H: перегрев при приготовлении, плохая вода, ошибка в навеске, добавки внесены в горячую среду, неправильно приготовленный тест-штамм. Порядок работы — в статье о приготовлении сред.

Источники

• ГОСТ ISO 11133-2016, текст на meganorm.ru — термины, дозы инокулята, PR и SF с критериями, методы для жидких сред, таблицы E.1 и F.1, приложения D, G и H
• МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» — область применения, биологические показатели, подготовка тест-штаммов, случаи внутрилабораторного контроля
• ОФС.1.2.4.0003.15 «Стерильность», Государственная фармакопея XIV издания — проверка ростовых свойств сред для испытания на стерильность

Материал подготовлен редакцией и ждёт проверки экспертами сообщества. Нашли неточность — напишите нам: исправления вносим и отмечаем дату.