Принцип
У многих бактерий есть триптофаназа — фермент, который расщепляет аминокислоту триптофан на индол, пировиноградную кислоту и ион аммония. Индол накапливается в среде, и его выявляют альдегидами. С п-диметиламинобензальдегидом — основой реактивов Ковача и Эрлиха — индол в кислой среде даёт красное соединение, с п-диметиламинокоричным альдегидом (DMACA) — сине-зелёное.
В реактиве Ковача альдегид растворён в амиловом или бутиловом спирте. Спиртовой слой собирается над культурой и концентрирует окрашенное соединение — отсюда «красное кольцо» на поверхности.
Зачем нужен
Подтверждение E. coli. По приложению А к ГОСТ 30726-2001 индол образуют 90–100 % штаммов E. coli. Тест входит в схемы подтверждения кишечной палочки в воде, продуктах и лекарственных средствах, но условия в документах разные:
| Документ | Объект | Среда | Инкубация | Учёт |
|---|---|---|---|---|
| ГОСТ 31955.1-2013, стандартный тест | питьевая вода | триптофановый бульон | (44,0 ± 0,5) °C, (21 ± 3) ч | 0,2–0,3 мл реактива Ковача, вишнёво-красная окраска на поверхности |
| ГОСТ 30726-2001 | пищевые продукты | бульон Хоттингера или мясо-пептонный бульон с триптофаном | (36 ± 1) °C, 24 ч | 1 см³ реактива Ковача или Эрлиха на 5 см³ культуры, красный слой; или индикаторная бумажка |
| ГОСТ 32011-2013 | E. coli O157 в продуктах и кормах | триптон-триптофановая среда | 37 °C, 24 ч | 1 см³ реактива Ковача, 10 мин при комнатной температуре |
В ГОСТ 31955.1-2013 E. coli в стандартном тесте — это колиформные бактерии, которые образуют индол из триптофана именно при (44,0 ± 0,5) °C; колонии с отрицательной оксидазной и положительной индольной реакцией учитывают как E. coli. В ГОСТ 30726-2001 индол определяют при 36 °C, а повышенную температуру (44 ± 1) °C применяют для другого признака — сбраживания лактозы на среде Гисса. Переносить режим из одного документа в другой нельзя. В фармакопейном испытании на E. coli по ОФС.1.2.4.0002.18 образование индола (красное кольцо с реактивом Ковача) проверяют вместе с отсутствием оксидазы и неспособностью утилизировать цитрат.
Как индольный тест соотносится с другими колиформными показателями — в статьях о колиформных бактериях в воде и о БГКП, ОКБ и E. coli.
Идентификация. Тест помогает различать энтеробактерии и другие грамотрицательные бактерии вместе с остальными биохимическими признаками.
Что понадобится
Среда — жидкая, богатая триптофаном, без глюкозы:
- триптофановый бульон по ГОСТ 31955.1-2013: триптический гидролизат казеина 10 г, L-триптофан 1 г, натрия хлорид 5 г на 1 л, pH 7,5, по 3 мл в пробирки;
- мясо-пептонный бульон с 0,05 г L-триптофана на 100 см³ или бульон Хоттингера — по ГОСТ 30726-2001;
- пептонная вода — только партия, проверенная на положительном контроле: в некоторых пептонах слишком мало триптофана.
Реактив Ковача. Пропись ГОСТ 31955.1-2013: 5 г п-диметиламинобензальдегида растворяют в 75 мл амилового или бутилового спирта, затем осторожно добавляют 25 мл концентрированной соляной кислоты плотностью 1,18 г/мл. ГОСТ 32011-2013 разрешает подогреть спирт на водяной бане до 44–47 °C, чтобы растворить альдегид, а кислоту добавлять после охлаждения.
- Готовят в вытяжном шкафу, в перчатках и очках.
- Хранят защищённым от света: при (5 ± 3) °C по ГОСТ 31955.1-2013 или во флаконе коричневого стекла при (3 ± 2) °C по ГОСТ 32011-2013.
- Годный реактив — от светло-жёлтого до светло-коричневого, без осадка. Тёмным он становится, например, если спирт был плохого качества.
Это не оксидазный реактив Ковача — о нём в статье об оксидазном тесте.
Реактив Эрлиха — п-диметиламинобензальдегид в этиловом спирте с соляной кислотой; в классической прописи одного производителя — 8,68 г альдегида, 174 мл концентрированной кислоты и 826 мл 95 % спирта. Он чувствительнее реактива Ковача, и его рекомендуют для бактерий, которые образуют мало индола: неферментирующих и анаэробов. Минусы — токсичные и горючие растворители и экстракция, без которой малые количества индола не выявляются (в ГОСТ 30726-2001 для E. coli реактив вносят прямо в культуру). Индол извлекают ксилолом: к 2 мл культуры добавляют 1 мл ксилола, встряхивают, дают растворителю всплыть и по стенке вносят 5 капель реактива. Положительный результат — красное кольцо сразу под слоем ксилола. Сам реактив Эрлиха реагирует не только с индолом; после экстракции красный цвет дают только индол и скатол.
Порядок постановки
- Возьмите изолированную колонию чистой культуры возрастом 18–24 ч. Смешанную культуру не используйте.
- Засейте пробирку со средой.
- Инкубируйте в аэробных условиях: при недостатке кислорода индола образуется меньше. Температура и время — по методике (см. таблицу выше); для идентификации обычно 37 °C 24–48 ч.
- Добавьте реактив Ковача в объёме, который задаёт методика, и осторожно встряхните.
- Оцените верхний слой — по UK SMI TP 19 примерно через минуту, по ГОСТ 32011-2013 через 10 минут: - положительный результат — розово-красная или вишнёво-красная окраска, обычно в первые секунды; - отрицательный результат — слой реактива остаётся жёлтым или желтовато-коричневым, иногда слегка мутным.
Тесты на бумаге и на мембране
Быстрый тест на фильтровальной бумаге. Бумагу кладут в чашку Петри и смачивают 1–1,5 мл реактива: 1 % DMACA или 1 % либо 5 % п-диметиламинобензальдегида. Покупную бумагу, уже пропитанную реактивом, сначала выдерживают до комнатной температуры. Петлёй растирают изолированную колонию 18–24 ч и сразу смотрят: с DMACA положительная реакция сине-зелёная, с п-диметиламинобензальдегидом — красная. Время учёта — по инструкции к реактиву.
- Тест на бумаге рассчитан на бактерии, которые образуют индол быстро; слабых продуцентов выявляет пробирочный метод. Поэтому отрицательный результат на бумаге при сомнении перепроверяют в пробирке.
- Колонию берут со среды, содержащей триптофан, например с кровяного агара. С агара МакКонки тест не ставят: индикатор pH и окраска лактозоположительных колоний мешают учёту. С некоторых хромогенных сред ставить можно.
Индикаторная бумажка по ГОСТ 30726-2001. 3–5 г п-диметиламинобензальдегида, 10 см³ концентрированной фосфорной кислоты и 50 см³ этилового спирта смешивают, пропитывают фильтровальную бумагу, сушат и режут на полоски шириной около 1 см. Жёлтые полоски хранят в темноте не больше месяца. Полоску закрепляют под пробкой пробирки с посевом; если за 24 ч при (36 ± 1) °C накопился индол, она становится сиренево-розовой или малиновой.
Индол на мембране. В ускоренном тесте ГОСТ 31955.1-2013 мембрану после двухэтапной инкубации — на триптон-соевом агаре при 36 °C, затем на триптон-желчном агаре при 44 °C — кладут на подложку с реактивом (0,5 г п-диметиламинобензальдегида в 100 мл соляной кислоты 1 моль/л) и облучают ультрафиолетом 10–30 минут; красные колонии учитывают как E. coli. Реактив должен быть светло-жёлтым, коричневато-жёлтый не используют. Разбавление концентрированной кислоты до 1 моль/л рассчитает калькулятор растворов. Что такое мембранная фильтрация — в словаре, пересчёт колоний на 100 мл — в калькуляторе мембранной фильтрации.
Контроль
- Положительный — Escherichia coli, по UK SMI TP 19 — NCTC 10418 или NCTC 12241 (это тот же штамм, что ATCC 25922, WDCM 00013).
- Отрицательный — Proteus mirabilis NCTC 10975.
В ОФС.1.2.4.0002.18 положительный контроль — E. coli, отрицательный — Salmonella Abony. Каждую новую партию пептонной среды проверяют на положительном контроле, реактив — на обоих. Соответствие номеров разных коллекций сверяйте по каталогу коллекции — подробнее в статье о тест-штаммах.
Ложные результаты
| Ситуация | Результат | Почему |
|---|---|---|
| среда с глюкозой | ложноотрицательный | кислота от сбраживания глюкозы снижает pH и подавляет образование индола; оптимум триптофаназы — pH 7,4–7,8 |
| пептонная среда с малым содержанием триптофана | ложноотрицательный | индолу не из чего образоваться |
| учёт до окончания инкубации | ложноотрицательный | слабые продуценты не успели накопить индол; вне стандартных методик отрицательную через 24 ч культуру инкубируют ещё сутки и повторяют тест |
| инкубация без доступа воздуха | ложноотрицательный | при недостатке кислорода индола образуется меньше |
| старый, потемневший или с осадком реактив | ненадёжный | проверьте цвет и реакцию на контролях, при отклонениях замените реактив |
| тест на бумаге со смешанной культуры | ложноположительный | индол диффундирует, колония могла соседствовать с индолположительной |
| анаэробы, особенно клостридии | ложноотрицательный | образуют индол и быстро его разрушают |
| реактив Эрлиха без экстракции ксилолом | ложноотрицательный или ложноположительный | малые количества индола не выявляются, а сам реактив реагирует не только с индолом |
Источники
- UK SMI TP 19 «Indole test», выпуск 4.1, 2025 — принцип, пробирочный и быстрый тест на бумаге, запрет теста с колоний МакКонки, влияние глюкозы и кислорода, сравнение реактивов, контрольные штаммы
- ГОСТ 31955.1-2013 (ISO 9308-1:2000), текст стандарта — определение E. coli по индолу при 44 °C, триптофановый бульон, пропись и хранение реактива Ковача, ускоренный тест на мембране
- ГОСТ 30726-2001, текст стандарта — индольный тест для E. coli в продуктах, индикаторная бумажка, реактивы Ковача и Эрлиха, доля индолположительных штаммов
- ГОСТ 32011-2013 (ISO 16654:2001), текст стандарта — триптон-триптофановая среда, пропись реактива Ковача, режим и учёт при подтверждении E. coli O157
- Remel: инструкция к реактиву BactiDrop Indole (Ehrlich's) — состав реактива Эрлиха, экстракция ксилолом, оптимум pH триптофаназы, ограничения теста
Материал подготовлен редакцией и ждёт проверки экспертами сообщества. Нашли неточность — напишите нам: исправления вносим и отмечаем дату.