Агар Бэрд-Паркера: подсчёт коагулазоположительных стафилококков

Состав и роль компонентов

Основа среды по ГОСТ 31746-2012 (п. 5.1.1), на 1 л воды:

К 100 мл расплавленной основы добавляют (п. 5.1.5):

• 1 мл 1 %-го раствора теллурита калия. Теллурит подавляет многие бактерии, в том числе большинство колиформ, а стафилококки его восстанавливают — поэтому их колонии чёрные или серые.
• 5 мл эмульсии яичного желтка (около 20 %). Среда становится жёлтой и непрозрачной, и по ней видна реакция с желтком.
• 2,5 мл раствора сульфаметазина — по необходимости: он подавляет рост и роение протея. Его вносят, если в продукте подозревают Proteus или исследуют сильно обсеменённые продукты, например сырое мясо.

Как выглядят колонии

Прозрачную зону и кольцо создают ферменты стафилококка, расщепляющие компоненты желтка. ГОСТ 31746-2012 называет эту реакцию лецитиназной активностью, а производители сред объясняют её по-разному: в одном техническом описании прозрачную зону связывают с протеолизом желтка, в другом непрозрачную зону — с лецитиназой, а просветление — с липазой (см. источники). Для работы важен не механизм, а вид колоний, описанный в методике.

Нетипичные колонии считают и подтверждают наравне с типичными: S. aureus без реакции с желтком встречается, особенно в сырах. Обратная ошибка тоже возможна — отдельные штаммы Staphylococcus saprophyticus дают похожие зоны, но, по данным производителя среды, позже, при более долгой инкубации. Этот вид входит в контроль специфичности среды (см. ниже).

Где применяется

• Пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов — ГОСТ 31746-2012. Стандарт модифицирован по отношению к ISO 6888-1:1999, ISO 6888-2:1999 и ISO 6888-3:2003. Кроме агара Бэрд-Паркера он допускает и другие селективные среды, но арбитражной назван именно он (п. 8.3.1). Способ посева (поверхностный, глубинный или накопление с расчётом НВЧ) выбирают по ожидаемому числу стафилококков — пороги указаны в разделе 1 стандарта.
• Молоко и молочная продукция — ГОСТ 30347-2016, где агар Бэрд-Паркера тоже предусмотрен.
• Международный метод — ISO 6888-1, действующее издание 2021 года: инкубация при 34–38 °C и обязательное подтверждение коагулазой. Для ферментированных продуктов с технологической стафилококковой флорой — сыров из сырого молока, части сырых мясных изделий — стандарт считает метод не вполне подходящим из-за нетипичных колоний и фоновой флоры.
• Воздух и смывы — МУК 4.2.4180-25 (воздух в медицинских организациях, с 30.07.2026 взамен МУК 4.2.2942-11) и МР 4.2.0220-20 (смывы на пищевых предприятиях, в общепите и торговле) допускают агар Бэрд-Паркера наряду с желточно-солевым агаром.

Детали ГОСТ 31746-2012 и ISO 6888-1:2021 различаются — работайте по документу из области аккредитации. Общие правила — в ГОСТ ISO 7218-2015.

Приготовление и хранение

• Основу стерилизуют при (121 ± 1) °C 15 мин; pH после стерилизации — 7,2 ± 0,2.
• Раствор теллурита стерилизуют фильтрованием через мембрану 0,22 мкм и хранят при (3 ± 2) °C не более месяца. Раствор с белым осадком не используют.
• Эмульсию желтка готовят из свежих яиц с соблюдением асептики и хранят не более 72 ч; промышленную эмульсию используют по инструкции изготовителя.
• Основу охлаждают примерно до 47 °C, добавки подогревают до той же температуры и вносят по очереди, перемешивая после каждой.
• Слой агара в чашке — около 4 мм. Готовые чашки хранят не более 24 ч при (3 ± 2) °C и перед посевом подсушивают.
• Теллурит калия токсичен при проглатывании (так он классифицирован в паспортах безопасности), хлорид лития МР 4.2.0220-20 называют ядовитым. Работайте в перчатках, избегайте контакта с кожей и пыли; подробности — в паспорте безопасности реактива.

Посев и подтверждение по ГОСТ 31746-2012

1. По 0,1–0,2 мл исходной суспензии и разведений засевают на поверхность двух параллельных чашек и распределяют шпателем.
2. Чашки инкубируют вверх дном при (37 ± 1) °C. Через (24 ± 2) ч отмечают типичные и нетипичные колонии, ещё через (24 ± 2) ч — вновь появившиеся.
3. Для подсчёта берут чашки, где всего не более 300 колоний, а типичных и нетипичных — от 15 до 150.
4. С каждой чашки на подтверждение отбирают пять типичных колоний, пять нетипичных или по пять тех и других — смотря какие есть.
5. Каждую колонию пересевают в бульон с вытяжкой из сердца и мозга и на скошенный агар, инкубируют при (37 ± 1) °C (24 ± 3) ч.
6. Проверяют окраску по Граму (грамположительные кокки, часто гроздьями) и каталазу — коагулазоположительные стафилококки каталазоположительны.
7. Коагулазный тест: 0,1 мл бульонной культуры добавляют к 0,3 мл плазмы кролика и инкубируют при 37 °C. Свёртывание проверяют через 4–6 ч, при отрицательном результате — через 24 ч или в срок, указанный изготовителем плазмы. Положительный результат — сгусток не ниже 3+ (большой сформировавшийся комок); 1+ и 2+ считаются промежуточными. Каждую партию плазмы проверяют: с добавлением стерильного бульона она не должна свернуться.
8. Чтобы отнести культуру именно к S. aureus, определяют образование ацетоина и сбраживание мальтозы в аэробных условиях. Термостабильную нуклеазу и гемолиз определяют только при необходимости — по эпидемическим показаниям, для оценки возможной энтеротоксигенности.

Расчёт результата

Для каждой чашки (формула 1 ГОСТ 31746-2012):

a = (bт / Bт) × Nт + (bат / Bат) × Nат,

где N — число типичных (т) или нетипичных (ат) колоний на чашке, B — сколько из них взяли на подтверждение, b — сколько подтвердилось.

Количество в 1 г или 1 мл: N = Σa / (V × n × d) для одного разведения или N = Σa / (V × (n₁ + 0,1 × n₂) × d) для двух последовательных, где V — объём посева на чашку, мл; n — число чашек; d — разведение (для двух — первое из них). Результат округляют по ГОСТ 26670.

Пример. Разведение 10⁻², по 0,1 мл на две чашки. На первой 50 типичных колоний, из пяти отобранных подтвердились четыре: a = 4/5 × 50 = 40. На второй 40 типичных и 10 нетипичных; подтвердились пять из пяти типичных и одна из пяти нетипичных: a = 40 + 2 = 42. N = 82 / (0,1 × 2 × 10⁻²) = 41 000, то есть 4,1 · 10⁴ КОЕ/г. Ту же формулу N использует калькулятор КОЕ — вместо числа колоний подставьте значения a. Калькулятор принимает только целые числа, поэтому дробные a (например, 3/5 × 47 = 28,2) считайте по формуле вручную; чашки для подсчёта выбирают заранее — по числу колоний, а не по a. Как записать результат, если колоний нет или их мало, — в статье о пределах подсчёта.

Контроль среды по ГОСТ ISO 11133-2016

Инкубация — при (37 ± 1) °C, 24–48 ч, для селективности — (48 ± 2) ч (таблица E.1). О хранении и пересевах штаммов — в статье о тест-штаммах.

Типичные ошибки

• Считают только типичные колонии. Нетипичные тоже отбирают и подтверждают, иначе результат занижен.
• Не подтверждают колонии коагулазой. Чёрные колонии на среде дают не только коагулазоположительные стафилококки.
• Смотрят чашки один раз через 24 ч и пропускают колонии, появившиеся к 48 ч.
• Нарушают границы подсчёта: чашка с более чем 300 колониями или неучтённые правила для малых количеств.
• Используют теллурит с осадком, старую эмульсию или чашки старше суток, вносят добавки в слишком горячую основу.
• Не добавляют сульфаметазин, когда подозревают протей или исследуют сильно обсеменённые продукты, например сырое мясо, — роящийся протей закрывает колонии.

Источники

• ГОСТ 31746-2012, официальное издание (скан) — состав и приготовление среды, описание колоний, порядок подтверждения, коагулазный тест, формулы расчёта
• ГОСТ ISO 11133-2016 на meganorm.ru — тест-штаммы и критерии для агара Бэрд-Паркера (таблица E.1)
• ISO 6888-1:2021 в каталоге AFNOR — область применения, температура инкубации, ограничения для ферментированных продуктов, замена издания 1999 года
• Neogen, Baird-Parker Agar (ISO), техническое описание — роль теллурита, лития, глицина и пирувата, природа зон вокруг колоний, сульфаметазин против протея
• Thermo Fisher, Baird-Parker Agar (ISO) Base — селективные компоненты, вид колоний, природа прозрачной зоны, S. aureus без реакции с желтком в сырах, реакция у S. saprophyticus

Материал подготовлен редакцией и ждёт проверки экспертами сообщества. Нашли неточность — напишите нам: исправления вносим и отмечаем дату.