Состав и принцип
Состав среды для испытания на стерильность приведён в ОФС.1.2.4.0003.15 «Стерильность» Государственной фармакопеи XIV издания. В ГФ XV новой редакции этой статьи нет: на сайте фармакопеи она значится действующей, и статьи XV издания ссылаются на неё. На 1000 мл воды очищенной:
| Компонент | Количество | Роль |
|---|---|---|
| панкреатический гидролизат казеина | 15,0 г | источник азота и аминокислот |
| дрожжевой экстракт водорастворимый | 5,0 г | витамины и факторы роста |
| глюкоза (моногидрат) | 5,5 г | источник углерода и энергии |
| натрия хлорид | 2,5 г | осмотический баланс |
| L-цистин | 0,5 г | восстановитель и фактор роста |
| натрия тиогликолят (или тиогликолевая кислота 0,3 г) | 0,5 г | основной восстановитель |
| агар микробиологический | 0,75 г | тормозит проникновение кислорода |
| раствор резазурина натрия 1:1000, свежеприготовленный | 1,0 мл | индикатор окисления |
pH после стерилизации — 7,1 ± 0,2. Стерилизуют в автоклаве при 121 °C 15 минут, если нормативная документация не требует иного. Промышленные среды могут отличаться по составу — главное, чтобы они выдерживали проверку ростовых свойств.
Как это работает. Тиогликолят натрия и L-цистин снижают окислительно-восстановительный потенциал среды, поэтому строгие анаэробы растут без анаэростата. Агара так мало, что среда остаётся жидкой, но он замедляет проникновение кислорода вглубь. В пробирке возникает градиент: сверху кислорода больше, на дне его почти нет. Тиогликолят заодно нейтрализует ртутные консерванты, например тиомерсал (мертиолят), — поэтому среда подходит для препаратов, которые их содержат.
Резазурин розовеет в присутствии кислорода, а в восстановленной толще среды бесцветен — поэтому свежая среда светло-соломенная. Узкий розовый слой у поверхности — норма: это зона, куда проникает воздух. По описанию изготовителя, у готовой среды он занимает не более 10 % столбика.
Как выглядит рост
| Где появляется рост | Какие микроорганизмы | Пример тест-штамма |
|---|---|---|
| у поверхности, в верхнем слое | строгие аэробы | Pseudomonas aeruginosa |
| по всей толще | факультативные анаэробы | Staphylococcus aureus |
| в нижней части пробирки | строгие анаэробы | Clostridium sporogenes |
Посевы просматривают в проходящем свете. Рост — это мутность, осадок, хлопья или другие изменения среды; по ОФС его подтверждают микроскопией.
Испытание на стерильность по ОФС
По ОФС.1.2.4.0003.15 используют три жидкие среды:
- жидкая тиогликолевая среда — для аэробных и анаэробных бактерий;
- жидкая соево-казеиновая среда — для грибов и аэробных бактерий;
- жидкая среда Сабуро — для грибов; для иммунобиологических препаратов (ИЛП) её применять не рекомендуют.
Препарат исследуют мембранной фильтрацией — всегда, когда он фильтруется, — или прямым посевом. Посевы инкубируют не менее 14 суток: тиогликолевую среду при 32,5 ± 2,5 °C, соево-казеиновую и Сабуро — при 22,5 ± 2,5 °C, независимо от метода посева. Для ИЛП допускается одна тиогликолевая среда с инкубацией при обоих режимах, если заранее проверены её ростовые и нейтрализующие свойства.
Что ещё обязательно:
- Отрицательные контроли — стерильный растворитель, разбавитель или среда — ставят параллельно с испытанием. Рост в них — основание признать результат недостоверным.
- Стерильность среды. Не менее 5 % ёмкостей каждой партии после стерилизации инкубируют без посева не менее 14 суток параллельно с испытанием — роста быть не должно.
- Проверка пригодности методики. Для нового препарата, при изменении условий испытания, состава или технологии проверяют, не подавляет ли препарат рост тест-штаммов. Если в контроле рост есть, а с препаратом нет, антимикробное действие устраняют разведением, нейтрализующей жидкостью или инактиваторами либо мембранной фильтрацией с промывкой фильтра.
- Мутнеющие препараты. Если препарат замутил среду и рост не виден, через 14 суток не менее 1 мл пересевают в свежую такую же среду; общий срок — не менее 14 + 4 суток. Для ИЛП пересев делают на 5–7-е сутки, а все посевы выдерживают 14 суток от первичного посева.
Ростовые свойства
По ОФС ростовые свойства определяют для каждой серии промышленной среды и каждой партии, приготовленной в лаборатории. Каждый тест-штамм вносят в количестве не более 100 КОЕ/мл в отдельную порцию среды, в 2 пробирки. Среда пригодна, если за отведённое время виден рост. Число пассажей рабочих культур — не больше пяти.
| Тест-штаммы для тиогликолевой среды (ОФС, таблица 3) | Температура | Срок |
|---|---|---|
| Bacillus subtilis ATCC 6633 или Bacillus cereus ATCC 10702; Staphylococcus aureus ATCC 6538; Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 | 32,5 ± 2,5 °C | 3 сут |
| Clostridium sporogenes ATCC 19404 | 32,5 ± 2,5 °C | 3 сут |
| только для ИЛП, когда среда универсальная: Alcaligenes faecalis 415 и Clostridium novyi 198 | 32,5 ± 2,5 °C | 2 сут |
| только для ИЛП, когда среда универсальная: Candida albicans ATCC 10231 | 22,5 ± 2,5 °C | 5 сут |
При универсальном применении среды для ИЛП посевы, по сноске к таблице 3, ведут при двух температурных режимах — 32,5 ± 2,5 °C и 22,5 ± 2,5 °C. ОФС допускает и другие штаммы из коллекций, если они типичны по свойствам. Один из изготовителей советует при проверке среды строгими аэробами ослаблять крышки на время инкубации, чтобы они росли лучше; в ОФС такого указания нет. В каталогах штамм ATCC 6633 теперь может значиться как Bacillus spizizenii, а ATCC 9027 — как Pseudomonas paraeruginosa; о переименованиях — в статье о новых названиях бактерий. Как хранить тест-штаммы — в статье о тест-штаммах.
Для ИЛП с тиомерсалом дополнительно проверяют нейтрализующие свойства: в пробирки вносят раствор тиомерсала и тест-штамм A. faecalis 415; рост должен появиться не позднее 5 суток при 32,5 ± 2,5 °C. Похожее испытание, но с посевом нескольких разведений и инкубацией при 34–35 °C, описано в МУК 4.2.2316-08 (п. 7.9).
Где ещё применяется
- выращивание аэробов, анаэробов и микроаэрофилов из фармацевтических и клинических образцов;
- пищевая микробиология: тиогликолевая среда входит в международный метод подсчёта Clostridium perfringens ISO 7937. Как её контролировать — в таблице E.1 ГОСТ ISO 11133-2016: тест-штамм C. perfringens WDCM 00007, (21 ± 3) ч при 37 ± 1 °C, норма — мутность 1–2 балла.
Изготовители указывают, что среда рассчитана на прозрачные жидкие или растворимые в воде материалы; для препаратов, которые мутят среду, ОФС предусматривает пересев.
Хранение и регенерация
- Приготовленную в лаборатории среду по ОФС хранят при 2–25 °C в защищённом от света месте не более 1 месяца или в течение иного срока, подтверждённого валидацией.
- Готовые промышленные среды хранят в плотно закрытых ёмкостях до конца срока годности, если сохраняются стерильность и ростовые свойства. Сухие — по инструкции изготовителя.
- Если розовым стало больше трети объёма, среду можно регенерировать: прогреть на кипящей водяной бане 10–15 минут до исчезновения розовой окраски и быстро охладить. Если окраска не ушла, среда непригодна. Регенерировать можно только один раз.
- Среду с признаками порчи — например, тёмно-янтарную — не используют.
Навеску сухой среды на нужный объём можно рассчитать в калькуляторе сред, общий порядок — в статье о приготовлении сред.
Чем отличается от среды Китта-Тароцци
| Тиогликолевая среда | Среда Китта-Тароцци | |
|---|---|---|
| как создают анаэробные условия | химические восстановители и немного агара | кусочки печени или мяса, слой вазелинового масла |
| индикатор кислорода | резазурин | нет |
| подготовка к посеву | регенерация, только если розовым стало больше трети объёма, и не более одного раза | прогрев на кипящей водяной бане перед посевом |
| главное применение | испытание на стерильность лекарственных средств | накопление клостридий из продуктов, воды, консервов |
Подробнее — в статье о среде Китта-Тароцци.
Типичные ошибки
- Перепутаны температуры: тиогликолевую среду ставят при 32,5 ± 2,5 °C, соево-казеиновую — при 22,5 ± 2,5 °C.
- Посев в среду, розовую больше чем на треть, без регенерации или после повторной регенерации.
- Не проверены ростовые свойства партии или стерильность среды — результат испытания могут признать недостоверным.
- Не проверено антимикробное действие препарата — отсутствие роста может быть ложным.
- Мутнеющий препарат не пересеяли через 14 суток — наличие роста не установить.
- Среду хранят на свету или дольше месяца без подтверждения срока валидацией.
Источники
- ОФС.1.2.4.0003.15 «Стерильность», Государственная фармакопея XIV издания — статус статьи, состав и pH среды, условия инкубации, контроли, ростовые свойства и тест-штаммы (таблица 3), хранение и регенерация
- HiMedia: Fluid Thioglycollate Medium M009, техническое описание — роль компонентов, нейтрализация ртутных консервантов, назначение среды, новые названия штаммов ATCC 6633 и 9027
- Gold Standard Diagnostics: Fluid Thioglycollate Medium, инструкция PLM3200 — кислородный градиент, резазурин, рост аэробов и анаэробов, крышки при инкубации, признаки порчи
- ГОСТ ISO 11133-2016, текст на meganorm.ru — контроль тиогликолевой среды для ISO 7937 (таблицы E.1 и E.2)
- МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» — нейтрализующие свойства тиогликолевой среды (п. 7.9)
Материал подготовлен редакцией и ждёт проверки экспертами сообщества. Нашли неточность — напишите нам: исправления вносим и отмечаем дату.