Коротко — для всех
Зачем это считают. Дрожжи и плесневые грибы — одни из главных виновников порчи продуктов: плесень на хлебе и сырах, брожение и вздутие соков, пюре и варенья, посторонний запах и вкус. Высокое количество грибов может говорить о нарушении гигиены, упаковки или условий хранения даже тогда, когда на вид продукт ещё нормальный.
Микотоксины. Часть плесневых грибов образует микотоксины. По данным ВОЗ, афлатоксины связаны с Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus и встречаются в кукурузе, пшенице, рисе, орехах и специях; охратоксин A образуют виды Aspergillus и Penicillium, его находят в зерне, сушёном винограде, кофе и вине; трихотецены, зеараленон и фумонизины связаны с грибами рода Fusarium; патулин — с подгнившими яблоками и яблочным соком. ВОЗ отмечает, что большинство микотоксинов химически устойчивы и переносят переработку продукта, а в правильно высушенном и сухо хранящемся продукте плесень обычно не растёт.
Важно не путать два разных исследования: подсчёт дрожжей и плесневых грибов не измеряет микотоксины. Это микробиологический показатель порчи и гигиены; сами токсины определяют отдельно, химическими методами.
Нормальный результат зависит от вида продукции: для одних групп продуктов нормируются дрожжи и плесени вместе, для других — по отдельности, для третьих показатель не применяется. Допустимые уровни собраны в приложении 2 к ТР ТС 021/2011 («Микробиологические нормативы безопасности») — в таблице по группам продукции; для отдельных видов продукции нормативы установлены в своих технических регламентах, например для молочной продукции — в ТР ТС 033/2013, для соков — в ТР ТС 023/2011.
Подробнее — для лабораторий
Документ
Методы выявления и подсчёта установлены ГОСТ 10444.12-2013 — он введён в действие с 1 июля 2015 года взамен ГОСТ 10444.12-88 и действует с поправками (последняя введена в действие с 24 апреля 2024 года и опубликована в ИУС № 7 за 2024 год). Стандарт распространяется на пищевые продукты и корма независимо от содержания активной воды, в том числе на продукты с низким её содержанием — менее 0,6. Для молока и молочной продукции с 1 июля 2016 года действует отдельный стандарт — ГОСТ 33566-2015, введённый взамен ГОСТ 10444.12-2013 в этой части; какой документ включён в область аккредитации, проверяйте по своей номенклатуре.
Среды
Селективные среды для грибов решают одну задачу: дать вырасти дрожжам и плесеням и не дать вырасти бактериям и расползтись быстрым грибам. В ГОСТ 10444.12-2013 (раздел 5) приведены:
| Среда | Особенности по стандарту |
|---|---|
| агар с дихлораном, бенгальским розовым и хлорамфениколом (DRBC) | хлорамфеникол подавляет бактерии, дихлоран и бенгальский розовый сдерживают расползание быстрорастущих грибов, так что колонии остаются компактными |
| среда Сабуро | для селективности в неё добавляют те же антибиотики; без антибиотиков основу допускается применять при проверке консервов на промышленную стерильность |
| солодовое сусло и сусло-агар | готовят по ГОСТ 10444.1-84 |
Допускаются готовые и сухие среды. Если в пробе много бактерий (сырое мясо, специи), стандарт советует сочетать хлорамфеникол с хлортетрациклином, а гентамицин не рекомендует: он угнетает часть дрожжей.
Среды с дихлораном и глицерином (DG18) в ГОСТ 10444.12-2013 нет: её применяют в международной практике (ISO 21527-2) для продуктов с активностью воды не выше 0,95 — сухофруктов, специй, орехов, кондитерских изделий, сухих мясных и рыбных изделий. Глицерин снижает активность воды самой среды примерно до 0,95, и на ней вырастают ксерофильные (засухоустойчивые) плесени, которые на DRBC растут плохо или не растут вовсе. Об агаре Сабуро — отдельная статья. Какую среду применять, определяет методика; навеску рассчитайте в калькуляторе сред.
Посев и инкубация
По ГОСТ 10444.12-2013 основной посев глубинный: по 1 см³ жидкого продукта или исходной суспензии вносят параллельно в две чашки Петри и заливают расплавленной средой, охлаждённой до (45 ± 1) °C; так же засевают десятичные разведения. Одну чашку заливают средой без посева — это контроль стерильности среды. Стандарт допускает и поверхностный посев: он даёт более высокие результаты подсчёта и исключает тепловое повреждение грибов, но результат может зависеть от их вида.
Инкубируют в аэробных условиях при (24 ± 1) °C в течение 5 суток, чашки ставят крышками вверх, не переворачивая. Через 3 суток делают предварительный учёт, через 5 — окончательный. Если в посеве есть мукоровые, то есть быстрорастущие грибы, предварительный учёт проводят особенно осторожно, чтобы их споры не осыпались и не дали рост вторичных колоний. Если роста дрожжей и плесеней нет, стандарт допускает оставить посевы после 5 суток при комнатной температуре ещё на 1–2 суток — медленнорастущие формы могут проявиться позже.
Для качественного ответа «обнаружено или нет» стандарт предусматривает посев в жидкую питательную среду примерно в соотношении 1:5 при том же режиме инкубации: рост дрожжей даёт муть, запах брожения и газ, рост плесеней — мицелий разной окраски. Выявлять грибы допускается и посевом в агаризованную среду, но тогда колонии не подсчитывают.
Как различают дрожжи и плесени
Разделяют их визуально:
| Группа | Как выглядит рост на плотной среде |
|---|---|
| дрожжи | крупные выпуклые блестящие колонии серовато-белого цвета, с гладкой поверхностью и ровным краем |
| плесневые грибы | мицелий различной окраски, колония пушистая или бархатистая, часто с цветным спороношением |
Если нужно убедиться, что колония дрожжевая, а не бактериальная, готовят препарат методом раздавленной капли и смотрят под микроскопом: клетки дрожжей крупнее бактериальных, округлые, овальные или продолговатые, часто с почками.
Пределы подсчёта
Здесь прячется самая частая ошибка. Пределы для грибов ниже привычных бактериальных (до 300 колоний на чашке, например 15–300 по ГОСТ 10444.15-94) и различаются между дрожжами и плесенями: для подсчёта отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 КОЕ дрожжей и (или) от 5 до 50 КОЕ плесневых грибов. Если колоний меньше, стандарт допускает подсчитать то, что выросло, но тогда в результате указывают нижнюю и верхнюю границы 95 % доверительного интервала по справочному приложению Б стандарта. Пример из стандарта: 8 колоний при посеве исходного разведения 1:10 записывают как 8,0·10¹ (от 3,0·10¹ до 1,3·10²) КОЕ на 1 г. Общая логика выбора чашек разобрана в статье «Сколько колоний считать на чашке».
В зависимости от цели испытания дрожжи и плесневые грибы считают по отдельности или вместе — это должно быть видно и в методике, и в протоколе.
Запись результата
Результат выражают в КОЕ на грамм или кубический сантиметр продукта с учётом использованного разведения. Если подходящие чашки есть в двух последовательных разведениях, число считают по формуле самого стандарта (пункт 9.3.2) — по сумме колоний на всех отобранных чашках, как взвешенное среднее; выражение результата — по ГОСТ 26670-91, общие требования — по ГОСТ ISO 7218-2015, подготовка проб — по ГОСТ 26669-85 или стандарту на конкретный продукт. Что такое КОЕ и почему это не «количество клеток», разобрано в статье «КОЕ/мл, КОЕ/г, КОЕ в 100 мл»; пересчёт разведений — в калькуляторе КОЕ.
Если в протоколе показатель один («дрожжи и плесневые грибы»), а считали вы раздельно, укажите, как именно получено итоговое число. Обратное тоже важно: нельзя записать раздельные значения, если фактически колонии считались суммарно.
Типичные ошибки
- Применяют бактериальные пределы подсчёта. Чашку с 10 колониями плесени отбрасывают как «мало», хотя для плесеней нижний предел — 5 колоний, а 200 колоний плесени считают, хотя верхний предел — 50.
- Расползшаяся колония мукора. Один быстрорастущий гриб за 5 суток закрывает чашку и делает подсчёт невозможным. Поэтому предварительный учёт через 3 суток — не формальность, а способ получить результат.
- Загрязнение из воздуха. Споры грибов есть в воздухе, на одежде, в пыли. Признак проблемы — колонии на контрольной чашке с незасеянной средой; такой результат не выдают, исследование повторяют. А вот непропорциональное снижение числа колоний плесеней по разведениям само по себе загрязнением не считается: стандарт объясняет его дроблением мицелия и распадом скоплений спор при разведении.
- Вскрытие чашек с проросшими плесенями на открытом столе. Споры разлетаются и дают вторичные колонии, которые завышают результат, и заражают соседние посевы; стандарт советует инкубировать чашки в пластиковом пакете, осматривать посевы лучше через дно чашки, а снимать материал — в боксе.
- Среда залита слишком горячей. Стандарт прямо упоминает риск теплового повреждения грибов при глубинном посеве, поэтому температуру заливки (45 ± 1) °C соблюдают строго: перегрев может занизить результат.
- Старые названия в протоколе. Родовые и видовые названия грибов пересматриваются; если в заключении упоминается конкретный род, сверяйтесь с действующей номенклатурой — об этом статья «Новые названия бактерий и грибов».
Результат трактует специалист. Статья объясняет смысл показателя и метод, но не заменяет заключение по конкретной пробе и не является медицинской рекомендацией.
Источники
- ГОСТ 10444.12-2013, полный текст стандарта — область применения, перечень сред (DRBC, Сабуро, сусло), посев и режим инкубации, различение дрожжей и плесеней, пределы подсчёта и пример записи, сведения о поправках
- ГОСТ 33566-2015, текст стандарта — область применения (молоко и молочная продукция), дата введения и замена ГОСТ 10444.12-2013 в этой части
- ВОЗ: Mycotoxins (информационный бюллетень) — какие грибы образуют микотоксины, в каких продуктах встречаются, устойчивость токсинов к переработке, роль сушки и условий хранения
- Описание среды с дихлораном и глицерином (DG18) — назначение среды, снижение активности воды глицерином, рост ксерофильных плесеней, которые плохо растут на DRBC
- ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» — официальный текст регламента; нормативы по дрожжам и плесеням — в приложении 2
Материал подготовлен редакцией и ждёт проверки экспертами сообщества. Нашли неточность — напишите нам: исправления вносим и отмечаем дату.