Среда Плоскирева: состав и принцип
Среда Плоскирева — плотная лактозная среда с сильными ингибиторами. В прописи отечественного производителя питательная основа — гидролизат рыбной муки с тиосульфатом и цитратом натрия и дрожжевой экстракт, к ним добавлены лактоза, фосфатный буфер и соль.
- Селективность создают три вещества: соли желчных кислот (их источник — очищенная желчь), бриллиантовый зелёный и йод. По данным производителя, они полностью подавляют грамположительную флору и в 2–3 раза ослабляют рост кишечной палочки, а рост шигелл и сальмонелл не сдерживают.
- Дифференцирующий признак — сбраживание лактозы. Индикатор — нейтральный красный: бактерии, которые образуют из лактозы кислоту, дают малиновые колонии. Шигеллы и сальмонеллы лактозу не сбраживают, и их колонии остаются бесцветными или слегка розовыми.
Готовая среда в чашках прозрачная, коричневато-красная.
Среда Левина: состав и принцип
Среда Левина — агар с лактозой, эозином и метиленовым синим; в зарубежной литературе — Levine EMB agar (от eosin methylene blue). В типичной прописи на литр приходится 10 г лактозы, 0,4 г эозина и 0,065 г метиленового синего, то есть красители взяты примерно в соотношении 6:1. Фосфат служит буфером.
- Селективность слабая. Красители подавляют лишь часть грамположительных бактерий. Отечественный производитель прямо указывает среду Левина и для выделения стафилококков: они растут медленно и мелкими колониями, учёт — через 48 ч.
- Дифференцирующий признак. При сбраживании лактозы pH снижается, комплекс эозина с метиленовым синим переходит в колонию и окрашивает её в тёмно-фиолетовый, почти чёрный цвет. Кишечная палочка образует особенно много кислоты, и на её колониях появляется зелёный металлический блеск. Бактерии, не сбраживающие лактозу, дают бесцветные колонии.
Как выглядят колонии
| Микроорганизмы | Среда Плоскирева | Среда Левина |
|---|---|---|
| Escherichia coli | малиновые, круглые, выпуклые, гладкие; рост ослаблен | тёмно-фиолетовые с зелёным металлическим блеском; у части колоний блеска нет |
| другие лактозоположительные бактерии (Klebsiella, Enterobacter и др.) | по принципу среды окрашенные, как и все сбраживающие лактозу | розово-красные или фиолетовые, обычно без металлического блеска |
| сальмонеллы | бесцветные или слегка розовые, нежные, гладкие, 1–2 мм | бесцветные, прозрачные |
| шигеллы | бесцветные или слегка розовые, нежные, гладкие, 1–2 мм | бесцветные или слабо-розовые, прозрачные |
| стафилококки и другие грамположительные бактерии | рост подавлен | частично подавлены; стафилококки дают мелкие бесцветные или светло-фиолетовые колонии с тёмным центром |
Бесцветная колония на любой из этих сред — только подозрение на шигеллу или сальмонеллу. Лактозу не сбраживают и многие другие бактерии, например протеи и синегнойная палочка. Подозрительную культуру идентифицируют биохимически — например, на средах Гисса — и серологически.
Чем различаются и что выбрать
| Среда Плоскирева | Среда Левина | |
|---|---|---|
| Селективность | высокая: грамположительные подавлены полностью, кишечная палочка — частично | слабая: подавлена лишь часть грамположительных |
| Ингибиторы | соли желчных кислот, бриллиантовый зелёный, йод | эозин и метиленовый синий |
| Индикатор лактозы | нейтральный красный | эозин и метиленовый синий |
| Вид E. coli | малиновые колонии | тёмно-фиолетовые с металлическим блеском |
| Главная задача | выделение шигелл и сальмонелл | дифференциация энтеробактерий по лактозе, выявление E. coli |
| Приготовление | кипячение, без автоклавирования | автоклавирование |
Выбор определяется задачей и методикой.
- Нужно выделить шигеллы и сальмонеллы из материала с обильной сопутствующей флорой — при прямом посеве или после среды накопления — подходит среда Плоскирева. Для сальмонелл есть и более специфичные среды, например висмут-сульфит агар.
- Нужно увидеть кишечную палочку и другие колиформы и отличить их от бактерий, не сбраживающих лактозу, — подходит среда Левина или близкая по задаче среда Эндо. Среда Плоскирева для этого не годится: она подавляет E. coli.
- Анализ ведут по стандарту или методическим указаниям — используют ту среду, которую называет методика. Например, агар Левина с эозином и метиленовым синим предусмотрен ISO 21150 — методом обнаружения E. coli в косметике. В ГОСТ 31659-2024 среды Плоскирева, Эндо и Левина упомянуты в справочном приложении E — среди примеров селективных сред, из которых выбирают вторую среду к XLD-агару при выявлении сальмонелл; их состав стандарт отсылает к инструкциям изготовителей. Инструкции отечественного производителя к обеим средам отсылают к методическим указаниям по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных энтеробактериями (1984).
Приготовление и хранение
Среда Плоскирева
- Среду не автоклавируют: в инструкции отечественного производителя предусмотрено только кипячение. Навеску размешивают в дистиллированной воде и кипятят около 3 минут, помешивая, до полного расплавления агара. Затем охлаждают до 40–45 °C и разливают в чашки слоем 5–6 мм.
- Перед посевом чашки подсушивают с открытыми крышками — у того же производителя 90–100 минут при 18–25 °C.
- Готовые чашки хранятся недолго: у того же производителя — не больше 2 суток в тёмном месте при 18–25 °C.
- Сухая среда гигроскопична и чувствительна к свету: банку держат плотно закрытой, в сухом тёмном месте.
Среда Левина
- Среду автоклавируют, режим — по инструкции: у одного производителя после кипячения и фильтрования 110 °C 20 минут, у другого 121 °C 15 минут. Перегревать среду нельзя.
- После стерилизации среду охлаждают примерно до 50 °C и осторожно перемешивают. Метиленовый синий при этом окисляется и возвращает синий цвет, а мелкий осадок, который входит в рабочий состав среды, распределяется равномерно.
- Среда чувствительна к свету: сухую среду и чашки хранят в темноте. Готовую среду отечественного производителя используют в течение 3 суток при хранении при 2–8 °C.
Готовые среды проверяют на стерильность и ростовые свойства на тест-штаммах — по инструкции производителя и общим правилам ГОСТ ISO 11133-2016. Подробнее — в статьях о приготовлении сред и о тест-штаммах. Навеску на нужное число чашек можно рассчитать в калькуляторе сред.
Типичные ошибки
- Среду Плоскирева автоклавируют по привычке. Производитель предусматривает только кипячение; при другом режиме заявленные свойства среды не гарантированы.
- На среде Плоскирева ищут кишечную палочку. Среда её подавляет, и результат будет занижен.
- Чашки Плоскирева готовят впрок. Срок их хранения считается сутками, а не неделями.
- Бесцветные колонии сразу записывают как шигеллы или сальмонеллы — без биохимической и серологической идентификации.
- Ждут металлический блеск у всех E. coli на среде Левина. У части колоний блеска нет, и вид по одному внешнему виду не определяют.
- Среду Левина не перемешали после автоклавирования или держали чашки на свету — среда получается неоднородной или теряет свойства.
- Ограничиваются одной селективной средой. Часть штаммов сальмонелл и шигелл на среде с эозином и метиленовым синим не растёт, а при малом числе возбудителей любая селективная среда может их пропустить. Поэтому параллельно сеют на вторую среду, отличающуюся по составу.
Источники
- ФБУН ГНЦ ПМБ: инструкция к агару Плоскирева-ГРМ — состав, принцип действия, вид колоний, приготовление без автоклавирования, хранение чашек
- ФБУН ГНЦ ПМБ: инструкция к среде Левина-ГРМ — состав, назначение (в том числе для стафилококков), вид колоний E. coli, шигелл и стафилококка, автоклавирование, хранение
- HiMedia: EMB Agar, Levine (M022), технический лист — принцип окраски колоний, соотношение красителей, перемешивание после автоклавирования, защита от света, рост контрольных штаммов, ограничения
- HiMedia: Levine eosin-methylene blue agar medium (M022I) — пропись по ISO 21150 для обнаружения E. coli в косметике
- ГОСТ 31659-2024, текст стандарта — приложение E: среды Плоскирева, Эндо и Левина среди примеров селективных сред
Материал подготовлен редакцией и ждёт проверки экспертами сообщества. Нашли неточность — напишите нам: исправления вносим и отмечаем дату.