Состав и принцип
XLD-агар предложил У. Тейлор в 1965 году — прежде всего для шигелл, которые плохо растут на средах с сильными ингибиторами. Позже среда стала одной из основных и для сальмонелл. Пептона в классической прописи нет: питательная основа — дрожжевой экстракт. Остальные компоненты отвечают каждый за свою реакцию.
| Компонент | Зачем нужен |
|---|---|
| дезоксихолат натрия | подавляет грамположительные бактерии |
| ксилоза | её сбраживают почти все энтеробактерии, кроме шигелл, поэтому колонии шигелл не желтеют |
| лизин | сальмонеллы, израсходовав ксилозу, декарбоксилируют лизин до кадаверина; среда вокруг колонии подщелачивается и снова краснеет |
| лактоза и сахароза в избытке | колиформные бактерии сбраживают их и продолжают закислять среду, даже если умеют декарбоксилировать лизин, — их колонии остаются жёлтыми |
| тиосульфат натрия и цитрат железа-аммония | индикатор сероводорода: в щелочной зоне H2S даёт чёрный сульфид железа — чёрный центр колонии |
| феноловый красный | индикатор pH: жёлтый при закислении, красный при подщелачивании |
Главная тонкость — связь кислотности и почернения. Чёрный центр появляется только в щелочной зоне, поэтому бактерии, которые образуют сероводород, но не декарбоксилируют лизин и закисляют среду сахарами, как правило, не чернеют. Как правило — но не всегда: у протеев и цитробактеров чёрный центр встречается.
Прописи XLD различаются. В классической прописи Тейлора, которую используют и фармакопейные методы, 2,5 г/л дезоксихолата и 3,5 г/л ксилозы, а в прописи по ISO 6579-1 — 1,0 г/л дезоксихолата и 3,75 г/л ксилозы. В отечественных вариантах бывает ещё и очищенная желчь. ГОСТ 31659-2024 (приложение B) приводит пропись ISO 6579-1, поэтому для работы по нему берут среду этого состава.
Как выглядят колонии
| Микроорганизмы | Колонии на XLD-агаре |
|---|---|
| сальмонеллы, образующие H2S (большинство) | красные, полупрозрачные, с чёрным центром; среда вокруг красная |
| сальмонеллы без H2S (S. Paratyphi A, отдельные штаммы S. Choleraesuis, S. Gallinarum и др.) | розово-красные без чёрного центра, иногда с более тёмным розовым центром — похожи на шигеллы |
| лактозоположительные сальмонеллы (редкие штаммы) | жёлтые, с почернением или без |
| шигеллы | красные или бледно-розовые, цвета среды, без чёрного центра, обычно мелкие |
| Escherichia coli | жёлтые, непрозрачные, плоские, с жёлтой зоной; рост частично подавлен |
| Enterobacter, Klebsiella | жёлтые, слизистые |
| Citrobacter | жёлтые или желтоватые, иногда с тёмным центром |
| Proteus | от жёлтых до красных, у многих штаммов чёрный центр |
| Pseudomonas, Providencia | красные, без чёрного центра |
| грамположительные бактерии | рост подавлен |
Описания цвета у производителей немного различаются: например, в одной отечественной инструкции колонии сальмонелл названы бесцветными с чёрным центром или без него. Поэтому новую партию среды сравнивают с ростом контрольных штаммов. Типичная колония на XLD — только подозрение: её подтверждают биохимически и серологически.
Место в ГОСТ 31659-2024 и ISO 6579-1
С 1 октября 2025 года действует ГОСТ 31659-2024 — метод выявления сальмонелл в пищевой продукции, кормах и пробах окружающей среды. Он заменил ГОСТ 31659-2012 и является модифицированным (MOD) вариантом международного стандарта ISO 6579-1:2017. Схема в общих чертах такая:
- неселективное предварительное обогащение в забуференной пептонной воде;
- селективное обогащение в двух средах — соевом бульоне Раппапорта — Вассилиадиса (RVS; для части проб — полужидкий агар MSRV) и бульоне Мюллера — Кауфмана с тетратионатом и новобиоцином (MKTTn);
- высев с обеих сред на XLD-агар — обязательную первую среду — и на вторую среду, которую лаборатория выбирает сама;
- подтверждение типичных колоний биохимическими и серологическими тестами.
По ГОСТ 31659-2024 чашки с XLD-агаром переворачивают вверх дном и инкубируют при (37 ± 1) °C в течение (24 ± 3) ч, а вторую среду — по инструкции её изготовителя.
Вторую среду подбирают так, чтобы она дополняла XLD. Реакции XLD построены на сахарах и сероводороде, поэтому лактозоположительные и H2S-отрицательные сальмонеллы на нём легко пропустить. В качестве второй среды используют, например, агар с бриллиантовым зелёным, хромогенные среды или висмут-сульфит агар. Для S. Typhi и S. Paratyphi в стандарте есть обязательное приложение D: к основной схеме добавляют обогащение в селенит-цистиновой среде и высев на висмут-сульфит агар — в дополнение к XLD.
XLD-агар входит и в другие методы: ISO 19250 (сальмонеллы в воде), фармакопейный контроль нестерильной продукции на сальмонеллы, клиническую диагностику кишечных инфекций.
Приготовление и хранение
- Не автоклавируйте. И ГОСТ 31659-2024, и инструкции производителей предписывают только нагрев: порошок размешивают в воде и при частом помешивании доводят до кипения, не допуская перегрева. Одни инструкции велят снять среду с огня сразу после закипания, другие допускают кипячение не дольше 1–2 минут.
- Среду охлаждают на водяной бане до 47–50 °C (по ГОСТ 31659-2024; в отечественной инструкции к сухой среде — до 40–45 °C) и сразу разливают. Большие объёмы готовить не стоит, держать среду долго на водяной бане тоже: от долгого нагрева выпадает осадок, и реакции колоний становятся менее чёткими. Лёгкий осадок допустим и на работу среды не влияет.
- Готовая среда прозрачная, красная или оранжево-красная.
- Сухая среда гигроскопична: банку держат плотно закрытой, в сухом месте, без прямого света, обычно при 2–30 °C.
- Сроки хранения чашек в документах сильно различаются: в ГОСТ 31659-2024 (приложение B) — не более 4 недель при (5 ± 1) °C без подсыхания, у отечественного производителя сухой среды — не более 2 суток в темноте при 18–25 °C. Срок берут из документа, по которому работает лаборатория.
- Чашки из холодильника перед посевом прогревают до комнатной температуры и при необходимости подсушивают, пока поверхность не станет сухой.
Каждую партию проверяют на стерильность, продуктивность и селективность. По таблице B.1 ГОСТ 31659-2024 продуктивность проверяют на Salmonella Typhimurium или S. Enteritidis (хороший рост колоний с чёрным центром), селективность — на E. coli (роста нет или он ослаблен, колонии жёлтые) и Enterococcus faecalis (рост полностью подавлен). Общие правила испытаний сред — в ГОСТ ISO 11133-2016, подробнее — в статье о тест-штаммах. Навеску на нужное число чашек можно рассчитать в калькуляторе сред.
Типичные ошибки и ложные колонии
- Среду автоклавировали или долго кипятили. Выпадает осадок, реакции нечёткие.
- Чёрный центр приняли за сальмонеллу. Чёрный центр бывает у протеев, цитробактеров, у редкой Edwardsiella. Без подтверждения такая колония — только подозрительная.
- Искали только колонии с чёрным центром. H2S-отрицательные и лактозоположительные сальмонеллы при этом теряются. Страховка — вторая среда и внимательный просмотр красных колоний без чёрного центра.
- Красную колонию без чёрного центра записали как шигеллу. Так же выглядят псевдомонады, провиденции и H2S-отрицательные сальмонеллы.
- Посевы читали слишком поздно. При долгой инкубации жёлтая окраска колоний может смениться красной, и картина путается. Время учёта — по методике; по ГОСТ 31659-2024 это 24 ± 3 ч.
- Посев слишком густой. Сливной рост скрывает цвет отдельных колоний; нужны изолированные колонии — см. статью о посеве штрихом.
- Взяли среду не той прописи. Классическая пропись и пропись по ISO 6579-1 различаются по селективным компонентам; для ГОСТ 31659-2024 нужна среда по его приложению B, то есть по ISO 6579-1.
Источники
- ГОСТ 31659-2024, текст стандарта — степень соответствия ISO 6579-1, схема анализа, XLD как первая среда, режим инкубации, пропись и приготовление XLD (приложение B), контрольные штаммы (таблица B.1), приложение D для S. Typhi и S. Paratyphi
- Biokar Diagnostics: XLD Agar (ISO 6579-1), технический лист — пропись по ISO 6579-1 и ISO 19250, принцип, приготовление без автоклавирования, вид колоний
- HiMedia: XLD Agar, Modified (M031I) — сальмонеллы без H2S и лактозоположительные, выбор второй среды, смена окраски при долгой инкубации
- BD BBL XLD Agar, инструкция — классическая пропись Тейлора, вид колоний E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas и шигелл
- ФБУН ГНЦ ПМБ: инструкция к XLD-агару — отечественная пропись, приготовление, вид колоний сальмонелл, шигелл, протеев и цитробактеров, хранение чашек
Материал подготовлен редакцией и ждёт проверки экспертами сообщества. Нашли неточность — напишите нам: исправления вносим и отмечаем дату.