Коротко — для всех
Что это. Bacillus cereus — бактерия, которая обычно живёт в почве и оттуда попадает на зерно, крупы, специи и овощи. Она образует споры, а споры переносят нагрев: при варке риса погибают не все, их количество снижается лишь на два-три порядка. По оценке Европейского агентства по безопасности продуктов питания (EFSA), группа B. cereus — это несколько близких природных видов бактерий; один из них, B. thuringiensis, применяют как биопестицид. Заболевание, связанное с этой группой, обычно проявляется тошнотой, рвотой и поносом.
Почему важна температура хранения. Опасность создаёт не сама варка, а то, что происходит с едой после неё. Пока блюдо остывает и стоит в тепле, уцелевшие споры прорастают, бактерии размножаются и могут накопить в продукте термостойкий токсин — цереулид (циклический пептид, связанный с рвотной формой отравления). Повторный разогрев его не разрушает. Вторая форма, диарейная, связана с энтеротоксинами, которые бактерии образуют уже в кишечнике после съедания. Поэтому готовую еду быстро охлаждают и убирают в холодильник: одной из важнейших мер EFSA называет хранение при температуре не выше 7 °C.
Продукты риска. Большинство вспышек связано с продуктами, прошедшими тепловую обработку; в обзорах главным источником называют готовые блюда с рисом и макаронами. В сухом виде носителями спор бывают крупы, рис, специи и сухие смеси. За 2007–2014 годы страны Евросоюза сообщили о 413 вспышках с убедительными доказательствами: пострадали 6657 человек, 352 были госпитализированы.
Нормальный результат зависит от вида продукции: для одних групп продуктов B. cereus нормируется, для других — нет. Допустимые уровни собраны в приложении 2 к ТР ТС 021/2011 («Микробиологические нормативы безопасности») — в таблице по группам продукции, а для части продукции — в технических регламентах на отдельные её виды. Норматив записан либо как предельное число КОЕ/г, либо как масса продукта, в которой B. cereus не допускаются, поэтому сверяйте результат именно со строкой своей группы продукции.
Подробнее — для лабораторий
Почему «презумптивные»
Метод установлен ГОСТ 10444.8-2013 — он модифицирован по отношению к ISO 7932:2004, введён в действие с 1 июля 2015 года взамен ГОСТ 10444.8-88 и распространяется на пищевые продукты, корма и пробы из производственной зоны.
Слово «презумптивный» в названии стандарта означает, что метод не разделяет B. cereus и несколько близких, реже встречающихся видов того же рода, которые в стандарте перечислены. Презумптивным считают микроорганизм, который дал типичные колонии на селективной среде и характерную реакцию при подтверждении по этому же стандарту. Поэтому в протоколе пишут именно «презумптивные Bacillus cereus», а не «Bacillus cereus»: видовая идентификация — задача отдельных методов.
Среда MYP
Основа среды — мясной экстракт, ферментативный перевар казеина, D-маннит, хлорид натрия, феноловый красный и агар; в расплавленную и охлаждённую основу добавляют раствор полимиксина B и яично-желточную эмульсию. Три компонента работают на результат:
| Компонент | Что даёт |
|---|---|
| полимиксин B | подавляет сопутствующую микрофлору, прежде всего грамотрицательную |
| маннит с феноловым красным | показывает, сбраживает ли культура маннит: B. cereus его не сбраживает, и колония остаётся розовой |
| яично-желточная эмульсия | выявляет лецитиназу — вокруг колонии появляется зона выпадения осадка |
Эмульсию готовят из свежих яиц, и хранить её по стандарту можно не более 72 ч при (5 ± 3) °C; добавки вносят в основу, охлаждённую до 44–47 °C. Разлитые чашки до подсушивания хранят при той же температуре до четырёх суток, поэтому партию среды планируют под объём работы. Рабочие характеристики готовой среды проверяют на тест-штаммах по ГОСТ ISO 11133-2016 (в самом ГОСТ 10444.8-2013 ссылка дана на заменённый ГОСТ ISO 11133-2-2011) — как это организовать, описано в статье о тест-штаммах; навеску рассчитайте в калькуляторе сред.
Посев, инкубация, вид колоний
Посев поверхностный: 0,1 или 0,2 см³ жидкого продукта или исходной суспензии распределяют шпателем по подсушенной поверхности среды в двух чашках, при необходимости — и в десятичных разведениях. Чтобы поймать небольшие количества, стандарт разрешает засеять 1 см³: на одну чашку диаметром 140 мм либо на пять чашек диаметром 90 мм, которые затем считают как одну (тоже в двух повторностях); предел обнаружения снижается в десять раз.
Чашки инкубируют при (30 ± 1) °C: основной учёт — через 18–24 ч, а если колонии видны неотчётливо, посевы оставляют ещё на сутки (общий диапазон по стандарту — 18–48 ч). Обратите внимание: 30 °C, а не 37 °C.
Для подсчёта отбирают чашки, предпочтительно двух последовательных разведений, на которых выросло менее 150 колоний. Типичная колония презумптивных B. cereus — крупная, розовая (маннит не сброжен) и обычно окружена зоной выпадения осадка (есть лецитиназа).
Стандарт сам предупреждает о двух ловушках. Если на чашке растут посторонние микроорганизмы, сбраживающие маннит, характерный розовый цвет может не проявиться — колонии бывают бледными или бесцветными. И часть штаммов B. cereus образует мало лецитиназы или не образует её вовсе, так что зоны осадка у них нет. Такие атипичные колонии тоже отбирают на подтверждение, иначе результат окажется заниженным. Сколько колоний вообще имеет смысл считать на чашке — в статье о пределах подсчёта.
Подтверждение
С каждой отобранной чашки берут пять типичных или атипичных колоний (или все, если их меньше). Если хорошо изолированных колоний нет, пять колоний сначала пересевают штрихом на ту же среду, инкубируют 18–24 ч при (30 ± 1) °C и берут на подтверждение изолированную розовую колонию.
- Гемолиз на агаре с бараньей кровью — арбитражный тест по стандарту. Отобранные колонии засевают штрихом так, чтобы реакцию можно было оценить, инкубируют при (30 ± 1) °C (24 ± 2) ч; подтверждающий результат — положительная реакция, ширина зоны гемолиза у разных штаммов различается. О самой среде — статья «Кровяной агар».
- Окраска по Граму и микроскопия: в мазках видны крупные грамположительные палочки, часто в цепочках, с центральными или субтерминальными спорами; в живом препарате клетки подвижны. Стандарт допускает заменить окраску тестом Грегерсена с раствором гидроксида калия. Как ставят саму окраску — в статье «Окраска по Граму».
- Редукция нитратов на нитратной среде — стандарт разрешает использовать этот тест вместо гемолиза при неарбитражных испытаниях.
Заключение о презумптивных B. cereus дают по совокупности признаков: подвижные грамположительные спорообразующие палочки, не сбраживающие маннит, с гемолитической или нитратредуцирующей способностью.
Как записать результат
В расчёт идут не все розовые колонии, а их число с поправкой на долю подтвердившихся: если из пяти отобранных подтвердились четыре, учитывают четыре пятых подсчитанных колоний. Расчёт и округление — по ГОСТ ISO 7218-2015 и ГОСТ 26670-91 (в тексте самого ГОСТ 10444.8-2013 ссылка дана на предыдущую редакцию ГОСТ ISO 7218). Результат выражают в КОЕ на грамм или кубический сантиметр — что означает эта единица, разобрано в статье «КОЕ/мл, КОЕ/г, КОЕ в 100 мл», а пересчёт разведений удобно делать в калькуляторе КОЕ.
Два случая стандарт описывает отдельно. Если на двух чашках с пробой или исходной суспензией выросло менее 15 типичных колоний, допускается приблизительный подсчёт, и тогда результат записывают по ГОСТ 26670-91 с нижним и верхним пределами 95 % доверительного интервала. Если типичных колоний нет совсем (пункт 10.2), пишут «менее 1» на кубический сантиметр для жидких продуктов и «менее 1/d» на грамм для остальных, где d — коэффициент разведения исходной суспензии.
Типичные ошибки
- Розовые колонии считают без подтверждения. Без гемолиза или альтернативного теста это ещё не презумптивные B. cereus.
- Атипичные колонии не отбирают. Бесцветные колонии на фоне маннит-положительной флоры и колонии без зоны осадка — тоже кандидаты.
- Чашка перегружена. При сплошном росте зону осадка не видно — нужно повторить с большим разведением.
- Эмульсия старше 72 ч или внесённая в слишком горячую основу — зона осадка может не сформироваться, и колонии B. cereus принимают за посторонние.
- Результат пишут как «Bacillus cereus» без слова «презумптивные», хотя метод видовой принадлежности не доказывает.
Результат трактует специалист. Статья объясняет смысл показателя и метод, но не заменяет заключение по конкретной пробе и не является медицинской рекомендацией; при симптомах отравления обратитесь к врачу.
Источники
- ГОСТ 10444.8-2013 (ISO 7932:2004), полный текст стандарта — состав среды MYP, срок хранения эмульсии, режим инкубации, описание типичных и атипичных колоний, порядок подтверждения, запись результата (раздел 10)
- EFSA: Public health risks of the Bacillus cereus group — состав группы, число вспышек в ЕС за 2007–2014 годы, хранение готовой еды не выше 7 °C
- Risk of Bacillus cereus in Relation to Rice and Derivatives (Foods, 2021) — две формы отравления, термостойкий цереулид, выживание спор при варке риса, роль блюд из риса и макарон, быстрое охлаждение
- ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» — официальный текст регламента; микробиологические нормативы, в том числе по B. cereus, — в приложении 2
Материал подготовлен редакцией и ждёт проверки экспертами сообщества. Нашли неточность — напишите нам: исправления вносим и отмечаем дату.